El Acido Hialurónico Promueve la División Celular de los Fibroblastos

• AUTOR: Greco R, Iocono J, Ehrlich H
• TITULO ORIGINAL: Hyaluronic Acid Stimulates Human Fibroblast Proliferation within a Collagen Matrix
• CITA : Journal of Cellular Physiology 177(3):465-473, Dic 1998
• MICRO: La presencia de ácido hialurónico en la matriz extracelular incrementa la tasa de división celular de los fibroblastos con avance en el ciclo celular. Estos mecanismos pueden guardar relación con la cicatrización de heridas in vivo.

Introducción

Cuando se conservan los fibroblastos humanos en una matriz de colágeno se observa un reordenamiento de las fibrillas que provoca la reducción en la contracción del entramado de colágeno que contiene fibroblastos (ECCF). Se ha demostrado la presencia de alteraciones en estas células cuando se las incorpora en las matrices de colágeno, en relación con la síntesis proteica y la morfología celular. Si bien se observa mayor lentitud en el inicio de la división celular, los fibroblastos humanos suspendidos en colágeno se caracterizan por la síntesis activa de ADN. De este modo, algunas células tienen un contenido de ADN en fase tetraploide, lo que permite suponer una detención del ciclo celular en las fases G2/M.

El ácido hialurónico (AH) es un glucosaminoglucano compuesto por la repetición de una secuencia de disacáridos formados por ácido D-glucurónico y N-acetilglucosamina. Los cambios en la concentración de AH en la matriz extracelular se asocian con la modulación de funciones celulares como la migración, la adhesión y la proliferación. Asimismo, se ha descrito su repercusión sobre procesos patológicos como la inflamación.

Por otra parte, tanto la división celular como el ECCF involucran la participación de microtúbulos. De acuerdo con los expertos, el agregado de AH al cultivo de líneas celulares de fibroblastos humanos se vincula con mayor expresión de tubulina, por lo que se presume que este efecto podría relacionarse con la progresión del ciclo celular. En este contexto, los investigadores se propusieron evaluar la presunta asociación entre esta acción del AH y la división celular.

Materiales y métodos

Se utilizaron 2 líneas celulares de fibroblastos humanos y se obtuvo colágeno nativo a partir del procesamiento de tendones aislados de cola de ratas. Del mismo modo, se dispuso de ECCF con 25 000, 80 000 o 100 000 células en función del experimento específico. El recuento celular se efectuó con un hemocitómetro después del procesamiento apropiado de los cultivos.

Tanto en el ECCF como en los cultivos en monocapas se efectuó un estudio de la captación de [³H]-timidina después de un período de incubación de 24 horas.

Por otra parte, se empleó AH estéril de 1.1 x 10⁶ daltons y se incorporó tubulina de origen porcino a los medios de cultivo mediante un procedimiento de electroporación. Las moléculas de esta proteína fueron tratadas con rodamina, para la interpretación de su incorporación a los microtúbulos en una evaluación por técnicas de fluorescencia.

Resultados

Los autores afirman que mediante la digestión por colagenasas se liberaron los fibroblastos del ECCF. El agregado de AH se asoció con el incremento en el recuento de estas células en el día 2. Así, en los modelos experimentales con 100 000 células por cada ECCF, el agregado de AH se relacionó con un aumento de 65%, 249% y 482% en la cantidad de elementos celulares en los días 2, 4 y 7, respectivamente. En cambio, en ausencia de AH, el recuento celular se elevó un 0%, 88% y 206%, en el mismo orden.

En coincidencia, en un medio con ECCF que contenía 25 000 fibroblastos en la fase inicial, la incorporación de AH se relacionó con un aumento del 96% en el recuento celular en el día 2 de la experiencia, en comparación con un incremento de sólo el 9% cuando no se agregó AH al cultivo. En el día 4, las cifras correspondientes fueron del 380% y del 144% y en el día 7 del 794% y del 170%.

Para descartar la posibilidad de efectos de un contaminante, se procesaron 4 muestras diferentes de un ECCF con 100 000 células, ya sea en presencia de AH, de hialuronidasa, la combinación de ambas o bien sin sustancias agregadas. Los expertos destacan que, en las primeras 24 horas se confirmó un aumento del 74% en el recuento celular sólo en el medio de cultivo expuesto a la acción del AH, sin modificaciones en los otros 3 modelos. Este incremento en la proliferación celular alcanzó el 358% en el día 2, sin cambios en los medios restantes de experimentación.

Como contrapartida, la exposición al AH de los cultivos de fibroblastos en monocapas no se asoció con un incremento de la división celular. Así, el agregado de AH a un ECCF con 80 000 células se vinculó con un aumento del recuento celular del 124% a las 24 horas y del 218% a las 48 horas, en comparación con el 13% y el 18%, respectivamente, obtenido en los cultivos en monocapas. De este modo, los autores aseguran que la respuesta de los fibroblastos a la presencia de AH fue mucho mayor en los ECCF que en los medios con capas únicas de células. Por otra parte, se señala que la mayor división celular relacionada con la exposición al AH no se asoció con cambios en la tasa de contracción del entramado de colágeno. Se destaca, además, que la incorporación de timidina fue mayor en presencia de AH entre los fibroblastos suspendidos en colágeno en comparación con aquellos presentes en los cultivos en monocapas.

En otro orden, los investigadores mencionan que, por medio de técnicas de citometría de flujo, se verificó que sólo el 13% de los elementos celulares de los ECCF incluyeron ADN tetraploide después de la exposición al AH. En cambio, esta tasa alcanzó el 46% cuando se agregó previamente hialuronidasa a las líneas celulares. De este modo, los expertos estiman que, al provocar la digestión enzimática del AH, se evitó el avance del ciclo celular a las fases G2/M.

Asimismo, mediante análisis de inmunotransferencia (Western blotting) se comprobó un incremento de la producción de tubulina en los ECCF expuestos al AH. Los autores postularon la hipótesis de una asociación entre la promoción de la proliferación celular por acción del AH y este incremento de la expresión de tubulina. En una experiencia conjunta, por técnicas de electroporación, se incorporó tubulina aislada y conjugada con un marcador fluorescente en el interior celular de los fibroblastos, antes de su incorporación al ECCF. En este modelo in vitro se observó que el área de los ECCF que contenían células con suplemento exógeno de tubulina se redujo de 960 a 221 ± 31 mm² a las 48 horas. En cambio, en los cultivos de control, la reducción del área fue menor y se estableció en 453 ± 77 mm². De este modo, la inoculación intracelular de tubulina en los fibroblastos provocó mayor contracción de la matriz en la etapa inicial, si bien este fenómeno no se verificó en la fase final. Dado que esta experiencia se repitió con resultados similares con otros preparados purificados de tubulina exógena, los autores interpretaron que el agregado de esta proteína en modelos con fibroblastos humanos se asoció con la estimulación de la división celular en los ECCF. Según el análisis de la citometría de flujo, el incremento de los niveles intracelulares de tubulina, además, se relacionó con una progresión en las etapas del ciclo celular.

Discusión y conclusiones

Los expertos señalan que se observa ralentización de la proliferación celular en los fibroblastos humanos suspendidos en una matriz de colágeno. Agregan que, en este ensayo, se comprobó que el agregado de AH incrementa la división celular mediante la eliminación del bloqueo del ciclo celular, con aumento asociado de la síntesis de ADN. Asimismo, señalan que la presencia de AH se relaciona con mayor concentración intracelular de tubulina. Por otra parte, la introducción de esta proteína mediante electroporación en el interior celular de los fibroblastos, antes de su incorporación a los ECCF, se vinculó con la progresión del ciclo celular.

Los microtúbulos forman parte de la contracción de la matriz de colágeno y de los haces necesarios para el proceso de mitosis. Tanto el agregado de AH como la inoculación directa de tubulina se asociaron con el incremento del contenido intracelular de esta proteína. La tubulina se relaciona con la progresión del ciclo celular de los fibroblastos humanos. De este modo, la presencia de AH indujo la división celular de los fibroblastos suspendidos en una matriz de colágeno a partir del día 1, en comparación con la necesidad de esperar 4 días para observar proliferación celular en ausencia de esta molécula.

Esta mayor tasa de división celular se asoció con el avance en el ciclo celular de los fibroblastos, de acuerdo con los resultados de las experiencias incluidas en este ensayo. Los autores afirman que tanto el receptor CD44 como el receptor para la motilidad mediada por AH interactúan en la membrana celular con el AH. La unión de esta molécula con el último receptor mencionado es un paso fundamental para la progresión de los fibroblastos en el ciclo celular, por medio de procesos de señalización intracelular que involucran el complejo Cdc2/ciclina tipo B1 con actividad de quinasa.

Durante la cicatrización in vivo se verifican cambios en la composición de la matriz extracelular. En una primera etapa, las heridas tienen mayor concentración de fibrina y, a continuación, se describe mayor contenido de AH. A medida que se detecta la maduración del proceso de granulación tisular, el AH es reemplazado por condroitín-6-sulfato. En el primer período de la granulación, la alta concentración de AH promueve la migración y proliferación de los fibroblastos. Cuando el condroitín-6-sulfato sustituye al AH, estos fenómenos se interrumpen. Los autores concluyen planteando la hipótesis de que la remoción del AH de la matriz extracelular forma parte del control de la proliferación de los fibroblastos en la maduración del tejido de granulación.

Especialidad: Bibliografía