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La carnitina, un nutracéutico con propiedades antiangiogénicas

  • TITULO : La carnitina, un nutracéutico con propiedades antiangiogénicas
  • AUTOR : Baci D, Bruno A, Noonan D y colaboradores
  • TITULO ORIGINAL : Acetyl-L-Carnitine is an Anti-Angiogenic Agent Targeting the VEGFR2 and CXCR4 Pathways
  • CITA : Cancer Letters 429:100-116, Ago 2018
  • MICRO : El trabajo investiga las propiedades antiangiogénicas inducidas por la inflamación en ensayos de laboratorio in vitro e in vivo.

Introducción

La inducción de un proceso angiogénico aberrante es un elemento común de múltiples enfermedades, con un componente inflamatorio crónico y fundamental en la provisión de oxígeno y de nutrientes para el crecimiento del tumor y su diseminación. Los agentes antiangiogénicos de uso clínico actual tienen como objetivo mecanismos asociados con el factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEV) y son eficaces solo en un grupo de pacientes, con recaídas frecuentes, y no están exentos de toxicidad. Por lo tanto, es imperioso identificar nuevos compuestos que superen estas limitaciones. Muchos de los esfuerzos actuales se centran en el estudio de derivados dietéticos (nutraceúticos) considerados de baja toxicidad y altatolerabilidad en las administraciones prolongadas con capacidad de prevenir o retrasar el proceso cancerígeno.

La carnitina (β-hidroxi-γ-N-αcido trimetilaminobutνrico) es un compuesto de amonio cuaternario de origen natural, esencial para el metabolismo energético lipídico en la mitocondria que, además, colabora en la regulación de las cadenas ramificadas de aminoácidos, el exceso de los grupos acil y la oxidación de los ácidos grasos peroxisomales. Su deficiencia se observó en diversas enfermedades, como la diabetes y el cáncer, y actualmente se estudia su uso en el debilitamiento y la neuropatía inducidos por la quimioterapia. La suplementación con carnitina ha mostrado retrasar el crecimiento del tumor en modelos con animales mediante la inhibición la histona desacetilasa (HDAC) y la carnitina palmitoiltransferasa (CPT1A y CPT1C).

En este trabajo se investigaron las propiedades antiangiogénicas y angiopreventivas in vitro e in vivo de la forma acetilada de la L-carnitina, acetil-L-carnitina (ALCAR) en células endoteliales de vena umbilical activadas por citocinas en ambientes normoxémicos, hipoxémicos e inflamatorios.

Materiales y métodos

El cultivo de células endoteliales de vena umbilical humana (EVUH) se realizó en un medio basal de células endoteliales suplementadas. Las líneas de células monolíticas humanas se obtuvieron de cultivo y las células mononucleares de sangre periférica, de muestras de sangre entera procesada y suplementada.

Para evaluar la formación de capilares a partir de células endoteliales in vitro las células EVUH se cultivaron en un medio especial y posteriormente se diseminaron en medios con matrigel polimerizado que contenía factor de crecimiento endotelial vascular (FCEV) y factor de crecimiento de fibroblastos 2 (FCF2), solos o junto con ALCAR. Posteriormente se visualizó en un microscopio óptico la formación de tubos en las células EVUH que se cuantificaron usando un software especial y la herramienta “analizadora de angiogénesis”. El experimento se realizó enun medio basal, enriquecido con factor de necrosis tumoral alfa (FNT-alfa) y en un medio hipóxico.

La adherencia se evaluó mediante la comparación de células EVUH en un medio completo tratadas con ALCAR con otro grupo sin tratamiento en muestras por triplicado. Para el estudio de la migración e invasión se utilizó una cámara de Boyden modificada.

Se extrajo el ARN y se cuantificó en un espectrofotómetro; posteriormente se realizó una transcripción inversa y una reacción en cadena de la polimerasa (RCP) en tiempo real. Todos los ensayos se hicieron por triplicado y se estableció la expresión genómica relativa.

Luego de lisar las células en un amortiguador (buffer) que contenía una mezcla de proteasas e inhibidores de la fosfatasa, se determinó la concentración de proteínas mediante el ensayo de Bradford, se separaron y posteriormente se expusieron los siguientes anticuerpos principales en un sustrato y con la técnica de electroinmunotransferencia (Western blot): antirreceptor 2 del factor de crecimiento del endotelio vascular (FCEVr2), antifactor inducido por hipoxia 1alfa (FIH-1alfa), antifactor nuclear kappa de cadena ligera potenciadora de las células B activadas (FN-κB) p65, antiproteína de unión específica de citoquinas (p-38 MAPK), antiprotooncogén de la tirosina-proteína-quinasa (p-Src), antiquinasa de adherencia focal (QAF), antifosfolipasa C-gamma 1 (p-FLCγ1), anti-FCEV, antimolécula celular de adherencia intracelular 1 (MCAC-1)y antimolécula celular de adherencia vascular 1 (MCAV-1). En un segundo tiempo se expusieron anticuerpos relacionados con peroxidasa IgG. Los datos del Western bloot se analizaron mediante un software. El efecto de ALCAR en la modulación de antígenos de superficie y la liberación de citoquinas se investigaron por citometría de flujo en un medio con células EVUH, con FNT-alfa y sin este.

La capacidad para inhibir la angiogénesis in vivo se evaluó mediante la inyección de líquido despolimerizado de matrigel mezclado con FCEV-alfa, FNT-alfa, heparina, solos o en combinación con ALCAR en ratas machos. El estudio se realizó siguiendo las guías de procedimientos italianas y de la Comunidad Europea y el protocolo fue aprobado por el comité de ética institucional.

Por último, se obtuvo una suspensión de células de las conexiones de matrigel para determinar la infiltración de células endoteliales y macrófagos.

El análisis estadístico se realizó mediante análisis de varianza (ANOVA) de una vía. Las diferencias en las curvas de crecimiento se determinaron mediante un análisis ANOVA de doble vía. Los datos restantes se procesaron con un software estadístico.

Resultados

Se observó que ALCAR inhibe significativamente la formación de redes capilares inducidas por FCEV/FCF2 en células EVUH cultivadas en matrigel (p = 0.0002) medidas por la cuantificación del número y la longitud de los segmentos maestros y el número total de áreas en malla (p = 0.0002).

ALCAR redujo significativamente la producción de superóxidos en las mitocondrias y la adherencia de células EVUH a una capa de fibronectina de un modo dependiente de la dosis (p < 0.0001). Interfirió en la migración (p = 0.0201) y la invasión (p < 0.0001) en una capa de matriz con suero bovino fetal (SBF) como quimioatrayente. Estos hallazgos estarían relacionados con la regulación por disminución de la molécula de adherencia plaquetaria y células endoteliales 1 (MAPCE-1), transcripción de QAF y regulación de selectina-P. El receptor de quimiocinas de tipo 4 CXC (CXCR4) y su ligando, el factor derivado del estroma celular (CXL12), componentes claves en los fenotipos migratorios proangiogénicos, fueron regulados por disminución a nivel de ARNm y proteínas. También se inhibió la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (CCL2), que actúa en células mononucleares e indirectamente en células endoteliales para sostener la angiogénesis inflamatoria (p < 0.0001).

ALCAR suprimió la síntesis de FCEV y FCEVR2 en las células endoteliales y estaría relacionada principalmente con la inhibición de la molécula de adherencia focal (MAF) en su transcripción y fosforilación, comprometiendo su papel en la proliferación celular, la supervivencia y la movilización. Asimismo, inhibió mecanismos inferiores y señales intermedias de FCEVR2, como las proteínas pTyr416-Src, p-38 MAPK y p-Ser1248-PLCγ1. En conjunto, parece producir un efecto antiangiogénico por medio de diferentes vías y un efecto directo en las señales de FCEV y FCEVR2.

ALCAR inhibe la morfogénesis celular inducida por hipoxia y FCEV mediante el bloqueo de la capacidad de las células EVUH de ensamblar estructuras capilares en un ambiente hipóxico en matrigel (p = 0.0001) de una manera que parece reflejar la disminución del factor inducido por hipoxia (FIH-alfa).

La inhibición de señales FN-κB de células activadas con FNT-alfa impidió su efecto regulador de la inflamación. Asimismo, se observó que el tratamiento con ALCAR seguido de la exposición a FNT-alfa disminuye la expresión de FCEV, FCEVR2 y CXCR4, críticos para la supervivencia de células endoteliales, migración e invasión. El estímulo inflamatorio también disminuyó por un efecto modulador en el reclutamiento de leucocitos.

Por medio de la prueba de esponja de matrigel se creó un microambiente local inflamatorio proangiogénico y se observó una reducción significativa del contenido endotelial y una disminución de la población de macrófagos, que confirmó los resultados in vitro.

Discusión

La angiogénesis y la inflamación son procesos complementarios de apoyo en la insurgencia y progresión de los tumores.

La suplementación con carnitina se reconoce como beneficiosa en los pacientes con déficit de carnitina, por ejemplo, aquellos con enfermedades crónicas inflamatorias como diabetes, enfermedad cardiovascular y cáncer.

La mayoría de los estudios de los efectos de la carnitina en la angiogénesis se enfocan en los transportadores de carnitina (CPT1 y CPT2) más que en la carnitina en sí. Este trabajo demostró que ALCAR actúa como antiangiogénico y angiopreventivo en ambientes hipóxicos y de inflamación. Su capacidad para inhibir pasos fundamentales de la angiogénesis manteniendo la transición del potencial de membrana de la mitocondria y suprimiendo la inducción de especies reactivas de oxigeno (ERO) reduce la generación de señales moleculares en las células endoteliales mayormente mediante la expresión de FCEV o de receptores FCEV (en su mayoría RVGFR2) tanto en la transcripción como en el nivel proteico. En condiciones hipóxicas y proinflamatorias, se observó una limitación eficaz del crecimiento tubular del endotelio, con disminución de la expresión de señales FCEV/RVGFR2, principalmente de la familia SRC/QAF y MAPK.

En presencia de angiogénesis patológica, ALCAR inhibe a nivel de su expresión proteica el eje CXCL12/CXCR4 y CCL2 en las puntas de los vasos en crecimiento. Además, reduce los niveles de transcripción de la proteína de la superficie celular PECAM-1, un importante conductor en la migración celular.

También se observó una reducción de la angiogénesis mediada por FNT-alfa disminuyendo la translocación de p-NF-κB en el núcleo y, por consiguiente, bloqueando quimiocinas y la adherencia de moléculas en la respuesta inflamatoria, lo que detiene el reclutamiento de macrófagos in vivo con disminución de la expresión de ICAM-1.

Los autores señalan que la carnitina inhibe la angiogénesis debida a inflamación por su capacidad antioxidante y efectos estabilizadores en la mitocondria. En este trabajo se identificaron los mecanismos moleculares principales a través de los cuales esto sucede, pero se encontró que la desaceleración de la angiogénesis se produce también por medio de otras vías de acción superpuestas, más allá de las ya estudiadas. Por lo tanto, sugieren su uso como suplemento en la prevención de los tumores y la angiogénesis inflamatoria en los sujetos con riesgo de presentar cáncer.

Especialidad: Bibliografía - Hematología

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